常見(jiàn)色譜儀的色譜分離原理
發(fā)布時(shí)間:2015-09-14 新聞來(lái)源:http://lzxrz.cn/ 瀏覽次數(shù):5498
高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與反相)、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及分子排阻色譜法。
1.液固色譜法:使用固體吸附劑,被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè)吸附-解吸附的平衡過(guò)程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁,粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分,大多數(shù)用于非離子型化合物,離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。
2.液液色譜法:使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面,或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相,分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè)分配平衡過(guò)程。
涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性;流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽和,以減少固定相從擔(dān)體表面流失;溫度的變化和不同批號(hào)流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化;另外在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失,現(xiàn)在已很少采用。現(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相,如C18、 C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法: 采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相);流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷),常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等)。
反相色譜法:一般用非極性固定相(如C18、C8);流動(dòng)相為水或緩沖液,常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛,據(jù)統(tǒng)計(jì),它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。
隨著柱填料的快速發(fā)展,反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大,現(xiàn)已應(yīng)用于某些無(wú)機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過(guò)程的解離,常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。但需要注意的是,C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5(2~8),太高的pH值會(huì)使硅膠溶解,太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。
3.離子交換色譜法: 固定相是離子交換樹脂,常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架,在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基(稱陽(yáng)離子交換樹脂)或季氨基(陰離子交換樹脂)。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行可逆交換,根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相。被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外,它還受流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度影響。pH值可改變化合物的解離程度,進(jìn)而影響其與固定相的作用。流動(dòng)相的鹽濃度大,則離子強(qiáng)度高,不利于樣品的解離,導(dǎo)致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。
4.離子對(duì)色譜法:又稱偶離子色譜法,是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測(cè)組分離子與離子對(duì)試劑離子形成中性的離子對(duì)化合物后,在非極性固定相中溶解度增大,從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。 分析堿性物質(zhì)常用的離子對(duì)試劑為烷基磺酸鹽,如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對(duì)。
分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽,如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。 離子對(duì)色譜法常用ODS柱(即C18),流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水,水中加入3~10 mmol/L的離子對(duì)試劑,在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測(cè)組分保時(shí)間與離子對(duì)性質(zhì)、濃度、流動(dòng)相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。
5.排阻色譜法:固定相是有一定孔徑的多孔性填料,流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中,滯留時(shí)間長(zhǎng);大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中,直接隨流動(dòng)相流出。它利用分子篩對(duì)分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物,如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。